Secvențierea ARN single-cell (II). Aspecte practice

Secvențierea ARN single-cell (II). Aspecte practice
2 cititori au dat 4.5

* În prezent există numeroase metode experimentale și de calcul pentru Secvențierea ARN single-cell
* Cea mai mare provocare experimentală o reprezintă izolarea celulelor reprezentative dintr-un organ sau țesut, fără a afecta expresia genică.
* Cea mai mare provocare în partea de calcul o reprezintă normalizarea datelor.

Un aspect important al izolării ARN-ului din celule vii este condiția ca celulele să nu fie “stresate” în procesul propriu-zis de izolare a ARN-ului. Toate procedurile de izolare a ARN-ului au o anumită influență asupra expresiei genice și uneori această influență nedorită nu poate fi ținută sub control. De exemplu, izolarea neuronilor duce la o expresie genică alterată, care face studierea transcriptomului acestor celule foarte dificilă.

Secvențierea ARN single-cell poate fi aplicată unui număr impresionant de celule, într-un studiu fiind secvențiate 1,3 milioane de celule din creier folosind tehnologia 10x Genomics.

Celulele sunt desprinse dintr-un țesut, iar apoi izolate, fie câte una pe rând (în procedura bazată de picuri – droplet-based), fie mai multe într-o cavitate, în procedura well-based, iar apoi aceastea sunt etichetate cu oligopeptide. Etichetarea permite repartizarea, după secvențiere, fiecărei molecule de ARN celulei de unde provine aceasta.

După izolarea și liza celulelor, se generează ADN complementar (ADNc) prin transcripția inversă a ARNu-lui mesager și sinteza ulterioară a strandului complementar. Acest ADNc este apoi amplificat prin reacția de polimerizare în lanț sau prin procedură de transcripție in vitro și este mai apoi transformată în librarii de secvențiere.

Există mai mult de 50 de protocoale publicate pentru efectuarea secvențierii ARN single-cell. Un protocol bun satisface cât mai multe dintre condițiile următoare (1) trebuie să fie sensibil și să detecteze ARN-ul mesager (2) trebuie să acopere în întregime moleculele de ARN mesager (3) trebuie să reflecte îndeaproape nivelurile de expresie genică (4) trebuie să poată fi aplicată unui număr mare de celule (5) trebuie să aibă costuri de implementare scăzute.

Pentru cuantificarea nivelurilor de expresie genică, citirile se mapează pe un genom sau transcriptom de referință, pentru a identifica locul de proveniență al ADN-ului complementar. Datele provenite din secvențierea ARN conțin multe citiri din spațiile intronice sau spațiile inter-genice. Aceste citiri se pot mapa greșit în cazul în care se folosește un transcriptom de referință, și nu un genom de referință. De aceea, este recomandată maparea citirilor pe un genom de referință, și nu pe un transcriptom. Deoarece cam între 10-15% dintre citiri se suprapun cu joncțiuni de splicing exon-intron, pentru mapare este necesară folosirea unor programe software care iau în considerare splicingul.

Pentru cuantificarea citirilor repartizate unei gene, se folosesc de regulă programe precum featureCounts și HTSeq.

Repartizarea citirilor către genele de unde provin acestea este un procedeu relativ simplu, deoarece genele se suprapun arareori. În schimb, repartizarea citirilor către transcrierile specifice este mult mai dificilă, deoarece adeseori diferite forme ale aceluiași transcript se suprapun.
De aceea, determinarea cantitativă la nivel de gene reprezintă standardul actual în secvențierea ARN single-cell, iar determinarea cantitativă la nivel de transcrieri trebuie folosită cu precauție.

Quantitative single-cell transcriptomics
Christoph Ziegenhain, Beate Vieth, Swati Parekh, Ines Hellmann, Wolfgang Enard
https://academic.oup.com/bfg/article/17/4/220/4951519

Alte articole din aceeași categorie

Ți-a plăcut articolul? Urmărește-ne pe Twitter @Streptococcul

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată. Câmpurile necesare sunt marcate *

Poți folosi aceste taguri și atribute HTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <strike> <strong>